科研動態

技術測評——外泌體研究有哪種方法可能取代超速離心?

2019/10/18

        細數近幾年的研究熱點,最火爆的莫過于外泌體。外泌體相關國自然基金支持力度也逐年上漲,2019年更是達到了2.54億元,較去年增長44.5%(圖1)。

圖片1.png

圖1 歷年國自然支持的外泌體研究基金

         外泌體分離是外泌體研究的第一步,也是至關重要的一步。只有得到高純度有活性的外泌體,才能在下游功能和內容物分析中獲得準確數據。然而,目前國際上還沒有特別完美的分離方法。         
         兩步超速離心(UC)分離法(圖2),是由法國居里研究院的Théry博士提出的,利用外泌體的理化性質分離外泌體的技術,該方法是目前最為經典的外泌體分離方法,也是文獻報道最多的分離方法。

01.jpg

圖2 超速離心法提取外泌體的實驗流程示意圖 
(Théry, C. et al. Curr Protoc Cell Biol ,2006)

        然而,UC分離方法過程繁瑣、耗時耗力。同時,UC分離方法,對操作人員經驗依賴性很強(相信很多人都有使用UC的痛苦回憶),導致實驗結果重復性很差。諸多因素限制了UC方法在外泌體生產和臨床上的應用。除此之外,UC方法從技術原理上還有一些更為致命的缺點,讓我們通過技術文獻的報道進行全面了解:


UC缺陷一:外泌體回收率低

圖片3.png

微信圖片_20191016134711.png

       為了驗證UC分離外泌體的效率,研究人員將收集沉淀后的上清繼續UC,如是四次,每次離心力為120,000 xg,離心時間為1h。經Western blot檢測,在重復UC后的沉淀中,CD63和TSG101的檢測值基本相同,并無下降趨勢(紅色方框)。說明超離后的上清中仍含有大量外泌體,揭示了UC方法分離外泌體效率低,回收率低的問題。


UC缺陷二:引起外泌體聚集并破壞其完整性       

        越來越多的證據表明,超高的速度離心會對外泌體的完整性產生負面影響:UC可能導致樣本中外泌體與其他非晶顆粒的聚集和共沉淀,甚至導致外泌體的破裂或與污染物以及其他蛋白質融合,影響外泌體的物理性質和下游分析。

圖片4.png

圖片133.png

圖片5.png

  免疫電鏡下,觀測到免疫膠體金標記(CD41)的超離后得到的外泌體發生聚集現象。
右圖為左圖白色方框放大后的景象,大量具有典型茶托狀結構的外泌體聚集在一起。


UC缺陷三:無法有效去除高峰度脂蛋白

圖片6.png

微信圖片_20191016140634.png

       研究人員對滑膜液經過相同的預處理后,分別使用超離(UC)、密度梯度離心(DGC)和尺寸排阻進行外泌體的分離。并通過WB、TEM對其進行鑒定分析。發現通過等蛋白質量的WB成像后,UC和DGC分離的外泌體的HDL標志物 apoa-1以及血清白蛋白(albumin)的條帶清晰可見,說明這兩種方法無法去除HDL和血清白蛋白。電鏡圖像顯示,超離后的背景較差,且發生外泌體與小顆粒非晶物質的聚集(紅色圓圈)。UC無法有效去除脂蛋白,對于下游的蛋白組學質譜實驗將是災難。      
         所以,亟需一種新的方法幫助外泌體科研人員走出困境。經過華盈生物的長期探索,終于在查閱大量文獻和研發摸索后,找到了這種方法——尺寸排阻色譜法(Size-exclusion chromatography,SEC)。
        SEC是將具有特定孔徑的多孔聚合物填充在分離柱中。當含有外泌體的樣本在重力作用下流經填充物時,粒徑小于微球孔徑的物質會進入到孔隙之中,被暫時捕獲。而大于孔徑的物質(如外泌體)則不會進入孔隙,更快的被洗脫出來,從而實現外泌體的分離純化。



微信圖片_20191016162743.png

        根據ISEV(國際胞外囊泡協會)開發的數據庫EV-TRACK統計,2017年,使用基于SEC方法分離外泌體的文章數量位居第二,僅次于超離。

微信圖片_20191018100316.png

(Marta Monguió-Tortajada , et al. CMLS, 2019)

       可見SEC方法已經得到越來越廣泛的認可。那么是什么原因,讓這種方法獲得如此高關注呢?下面我們通過文獻和數據對比,向大家一一呈現。


SEC優勢一:雜蛋白去除率高,純度高

微信圖片_20191016141849.png

圖片8.png

        研究人員對比了SEC和UC分離外泌體的純度,使用ELISA試劑盒分析了分離后的外泌體中鐵蛋白復合物的污染情況,發現SEC與UC相比,該蛋白的豐度降低了100倍。經過進一步的蛋白組學分析,發現兩種方法都能夠很好的匹配外泌體相關蛋白,但是UC制備外泌體中含有大量獨特的圖譜蛋白。表明SEC分離的外泌體具有更高的純度。


SEC優勢二:外泌體結構完整,功能活性高

圖片9.png

微信圖片_20191016142115.png


        該實驗基于CPC(心肌祖細胞)衍生的外泌體通過誘導ERK磷酸化,激活 MAPK1/2-ERK1/2通路,進而刺激人微血管內皮細胞(HMECs)遷移,這樣一個前提。研究人員分別使用UC和SEC分離CPC培養上清中的外泌體,刺激HMECs,通過比較外泌體刺激后的pERK / ERK,分析兩種方法所得外泌體在功能活性上的差異。       
        在之后的實驗中,實驗人員先是分析了相同總蛋白質量下的Western Blot結果,通過對比,SEC制備外泌體的pERK / ERK比UC更高,兩個蛋白質量下的兩次重復結果相同。但是考慮到可能SEC方法制備的外泌體純度更高,相同蛋白質量內含有的外泌體更多,從而pERK/ERK更大。于是研究人員又進行了相同總粒子數下的pERK/ERK對比,結果相同。表明SEC制備外泌體具有更高的活性,更適合進行功能學研究。   


SEC優勢三:操作簡便,耗時短,重復性高

       超離飽受詬病的另一個問題是,UC的重現性差且耗時長,需要操作人員有一定的經驗和技巧。相對于超離,SEC的操作則簡單很多,只需按要求收集相應組分的溶液,即可獲得純度較高的外泌體,無需掌握特殊技巧,重復性高。而且SEC耗時方面也有明顯的優勢,只需15~20min即可完成外泌體的分離工作。

UC和SEC操作難度及耗時對比圖

00.png
0

qEV視頻.jpg

        在2019年刊登于Cellular and Molecular Life Sciences的一篇綜述中,作者通過將指標量化打分的形式,來評估目前所有的外泌體分離方法,最終SEC的綜合得分最高(28分),在純度、得率、功能活性、成本以及易用性等方面都優于得分為21分的UC。

圖片11.png

外泌體分離方法對比
01011.png

         綜上所述,SEC在方方面面都有著取代UC的潛力,有望成為下一個外泌體分離方法的主流,讓我們拭目以待!

         那么,問題來了,在哪能夠買到SEC呢?

        華盈生物技術人員也是操碎了心,專門從新西蘭的IZON公司引進了qEV外泌體分離柱(SEC)系列產品,以滿足中國科研人員的多元化需求。        
         根據樣品體積和理化性質的不同,qEV共分為5個產品類型,可兼容血漿、血清、胸水、腹水、腦脊液和尿液等多種樣本類型。其中qEVoriginal為最常用類型,而qEV100是新上市產品,上樣量100mL,可滿足體積大濃度低的樣本,如細胞培養上清和尿液等。

微信圖片_20191015161002.jpg

        根據下游分析對外泌體純度和濃度的不同需求,每個類型的分離柱又分為35nm和70nm兩種規格,用戶可根據自身需求選擇。對比圖如下:

微信圖片_20191016144422.png

        除了分離柱,還有配套的分離柱支架,以及自動組分收集器(AFC),供客戶選購。

圖片12.png

        AFC(Automatic Fraction Collector)是IZON自主研發的外泌體自動收集裝置,是qEV平臺的一項重大改進,實現了自動化智能化分離外泌體。

具有以下優勢:

●   高效性:可同時批量處理多個樣本。

●   易操作:通過觸控屏操作,設定簡單易懂,機身輕巧。

●   高精度:精確測量每個液滴的重量。

●   自動化:自動收集外泌體,并通過LED氛圍燈實時反饋信息。

       此外,收集到外泌體后,我們不得不對外泌體的質量進行快速評估,這就需要介紹另外一款神器,基于TRPS技術的qNano納米粒子分析儀。TRPS技術可以在幾分鐘內完成1例外泌體樣品的粒徑、粒子數、zeta電位等信息的記錄與分析,是SEC下游的理想技術,技術優勢橫掃目前的NTA技術。

外泌體圖片.jpg

        關于qNano這款神器的介紹,請聽下回分解哦!!

        華盈生物作為新西蘭IZON在中國的特約合作伙伴和示范實驗室,還可以為您提供基于SEC和TRPS技術的外泌體研究技術服務,協助您用最小的成本體驗到SEC和TRPS技術的魅力。 

垂詢熱線: 021-33938791-8012
QQ: 2120485725 
(本文作者:GP)

 

 

11选5下期推算方法 哈灵作弊软件 资产配置之私募股权投资基金 老版吉祥棋牌下载安装 北京pk赛车是不是合法的 平码四中四图 六肖公式规律计算法 朋友局河南麻将一直输 玩股票怎么玩 信誉度好的棋牌游戏 浙江6十1怎么算中奖