科研動態

華盈視角:糖蛋白研究新工具-人凝集素芯片

2016/08/01

 

     

      蛋白質糖基化是目前已知的較為復雜和廣泛的蛋白翻譯后修飾,其中具有代表性的就是血清蛋白的糖基化。根據前期研究報道,糖基化修飾異常與包括癌癥在內的廣泛疾病存在相關性。近日,華盈生物的合作伙伴——上海交通大學陶生策教授課題組構建了首張人凝集素芯片,成為替代植物凝集素芯片的新型糖蛋白研究工具。相關研究成果7月發表在蛋白質組學領域專業國際期刊Molecular & Cellular Proteomics上PMID:27364157)。

        截止到目前,高效的糖基化分析研究多采用凝集素芯片,而現有芯片上點制的凝集素多取自于植物凝集素,對于人類樣品中復雜糖蛋白的分析存在困難。人體中也存在凝集素或類凝集素蛋白質,大多數是整合在細胞膜上的跨膜蛋白質,也有部分是可溶性蛋白質和分泌蛋白質。由于是人類細胞的內源蛋白,這些人凝集素蛋白對于人類樣品中的糖蛋白糖鏈的結合力和分辨率更高。據此,上海交通大學的陶生策研究組,挑選并克隆出60種人類凝集素和類凝集素基因,通過酵母系統進行凝集素全長蛋白的表達,構建出了世界上第一張人凝集素蛋白芯片。



                                                                  圖1. 人類凝集素芯片的制備及應用流程圖


人凝集素芯片的制備和質控


        研究人員通過Gateway系統的LR反應構建出人凝集素克隆表達質粒,將其轉入釀酒酵母菌株中進行蛋白的表達純化,得到高質量的帶GST標簽的重組凝集素目的蛋白。
        銀染結果表明:大多數純化的重組凝集素和類凝集素的大小與預期一致,表達量高且條帶清晰,適于制備凝集素芯片(如圖2)。



                                                                       圖2.  重組凝集素和類凝集素的純化


        隨后,研究人員按照每張芯片12個Block,每種蛋白設置3次技術重復的形式將人凝集素固定在芯片片基上,形成了最終的凝集素芯片。為鑒定芯片質量,研究人員采用抗GST的抗體對芯片進行質檢,質檢結果符合要求(如圖3)。

 


                                                                       圖3.  人類凝集素芯片的質控掃描圖


人凝集素芯片的應用可行性評價


        進一步,研究人員將分別用熒光標記的THP-1細胞裂解液以及經PNGase酶處理(去除糖蛋白N-鏈接糖基化)的THP-1細胞裂解液分別與凝集素芯片進行孵育反應。對芯片進行熒光掃描,并系統性分析芯片數據后發現:THP-1細胞裂解液中的糖蛋白與人凝集素芯片上26種重組凝集素蛋白有結合。并且,經PNGase處理后,這26種凝集素捕獲的信號值均顯著降低(如圖4),說明該研究構建的人凝集素芯片對于糖蛋白糖鏈檢測具有足夠的敏感性,可用于生物樣本的糖基化差異分析。

                                  


                                                                                                   圖4. 人凝集素活性驗證

 

凝集素芯片應用—精子表面糖基化研究


        研究人員利用人凝集素芯片對精子表面的糖基化進行了篩選。發現了5種凝集素(GalNac-T6, galectin-1, ERGIC-53, galectin-8 和 galectin-7)與精子表面糖蛋白顯著結合。其中, Galectin-8信號較強(如圖5)。


       

     


                                                                              圖5.  5種凝集素與精子高度結合


        進一步,通過流式細胞分析及免疫熒光驗證,發現這幾種凝集素與精子細胞表面結合的位置不同。如:Galectin-8與精子的全長均強烈結合,而ERGIC-53僅僅與精子頭部和頸部結合(如圖6)。

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                                                                            圖6.  精子表面糖蛋白的不同分布

質譜鑒定Galectin-1結合精子蛋白


        利用重組凝集素蛋白Galectin-1與精子膜蛋白進行pull down實驗,將其結合的糖蛋白進行質譜分析,發現Galectin-1能夠捕獲精子上的多種膜相關蛋白質,其中就包括兩種熱休克蛋白:HSP90和HSP70(如圖7)。


                                                             圖7.  LC-MS分析鑒定Galectin-1結合膜相關蛋白


糖蛋白研究案例拓展—癌癥標志物研究


        糖基化修飾在細胞膜和血清蛋白中的比例非常高,是否糖基化以及糖基化程度與疾病的發生和發展密切相關。因此,進行不同疾病血清或組織樣本中蛋白糖基化的篩選往往成為發現特異生物標志物的有效途徑。

        近日,復旦大學顧建新教授研究組就開展一次大規模血清蛋白糖基化的研究項目,評估了12種癌癥類型與非惡性對照中IgG糖基化的修飾的調變情況,發現IgG蛋白的半乳糖比值(Gal-ratio)差異可以顯著區分多種癌與對照樣本,與經典標志物聯合應用更能夠顯著提高其診斷效力。該研究成果發表在7月的Cell Research雜志上(PMID:27364686)。

        研究人員利用收集自多家醫院的大量樣本評估了在12種癌癥類型中IgG半乳糖基化的分布情況,在兩個獨立的組群中證實IgG半乳糖比值(Gal-ratio)顯示出共同的特征。分析IgG半乳糖比值可以將這12種癌癥類型與非癌性對照顯著區分開來。當采用IgG半乳糖比值來區分早期階段癌癥與非癌性對照時也獲得了相似的結果(如圖8)。

                             


                                                       圖8 .  IgG的Gal-ratio可以作為特異生物標志物   

                                                                          


        上述結果表明,IgG半乳糖基化比例有潛力作為一種非侵襲性的泛癌癥生物標志物,用于早期癌癥檢測和癌癥篩查。

        綜上,作為一種廣泛存在的蛋白質修飾,糖基化研究一直為生物醫學領域科學家所關注。但受到分析方法和分析工具的限制,糖基化研究的進展相對其它研究更為緩慢。人類凝集素蛋白芯片的誕生將會為蛋白糖基化研究增添新的動力。

       
上海華盈生物醫藥科技有限公司位于上海張江高科技園區,是醫學生物技術領域的特色高科技企業。與Full Moon、Raybiotech、CDI、Bio-Rad、R&D等多個主流蛋白芯片國際專業公司結成戰略合作伙伴關系。引進和開發了多個蛋白與抗體芯片檢測平臺和系列產品,包括凝集素芯片、Luminex液相懸浮芯片、人類19394種蛋白質組芯片、信號通路磷酸化抗體芯片、蛋白表達抗體芯片和蛋白質譜等先進的蛋白高通量研究技術,全力打造蛋白質研究的“一站式”科研服務體系。?
       
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        英文文獻鏈接:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27364157
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=PMID%3A+27364686


 

 

 

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